실험 개요
DNA 추출은 PCR·시퀀싱·마이크로어레이 등 거의 모든 분자생물학 실험의 출발점이다. 학부 실험에서는 식물(CTAB법)·동물 조직(SDS법)·박테리아(Wizard 컬럼키트) 모두 다루며, 추출 후 분광광도계 OD260/OD280 또는 NanoDrop으로 농도와 순도를 평가하고 아가로스 겔로 무결성(degradation 여부)을 확인한다. 예비보고서에서는 각 시약의 역할(SDS·CTAB·Proteinase K·EDTA·이소프로판올)을 단계별로 명확히 적어야 한다.
이론 배경
세포 용해 (lysis)
동물세포: SDS(소디움도데실설페이트) 1% — 막 단백질 변성. 식물세포: CTAB(세틸트리메틸암모늄브로마이드) — 다당류 결합·제거. 박테리아: 리소자임으로 펩티도글리칸 분해 후 SDS. 모든 경우 EDTA로 DNase 활성 억제 (Mg2+ chelation).
단백질 제거
Proteinase K (50~200 μg/mL, 56°C 1h): 단백질 분해. Phenol-chloroform 추출: 단백질이 organic phase로, DNA는 aqueous phase에 잔류. 키트는 silica column이 DNA를 chaotropic salt(GuSCN) 존재 하 결합시키고 단백질·RNA는 통과.
DNA 침전·정제
0.1 vol 3M NaOAc + 2.5 vol cold ethanol (또는 0.7 vol isopropanol) → DNA 응집. 70% EtOH 세척 (염 제거). 공기 건조 후 TE buffer(10 mM Tris·1 mM EDTA, pH 8) 또는 DNase-free water에 재용해.
농도·순도 평가
분광광도계 OD260: 1 = 50 μg/mL dsDNA. OD260/280 ≥ 1.8: 단백질 오염 적음. OD260/230 ≥ 2.0: 페놀·구아니딘 오염 적음. 1.6 미만이면 단백질 잔존, 1.5 미만이면 RNA 오염 의심.
실험 장치 및 시약
- — CTAB 또는 SDS lysis buffer
- — Proteinase K (20 mg/mL stock)
- — Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) 또는 Wizard 컬럼키트
- — 100% ethanol·70% ethanol·isopropanol (-20°C)
- — 원심분리기 (12,000~15,000 g)
- — 마이크로피펫 + 멸균 1.5 mL 튜브
- — NanoDrop 또는 분광광도계 (260·280·230 nm)
- — 1% agarose gel + EtBr 또는 SYBR Safe
실험 절차
- 1.[CTAB 식물법] 잎 100 mg을 액체질소로 갈기 → CTAB buffer 700 μL + 65°C 30 min.
- 2.Phenol-chloroform 700 μL → 14,000 g 10 min → 상층액 회수.
- 3.이소프로판올 0.7 vol → -20°C 30 min → 14,000 g 15 min → DNA pellet.
- 4.70% EtOH 세척 1 mL → 7,000 g 5 min → 풍건.
- 5.TE buffer 50 μL 재용해 → NanoDrop 측정.
- 6.선택: 1% 아가로스 겔에 5 μL 로딩 → DNA 무결성 확인 (genomic은 wells 근처 single high-MW band).
데이터 처리
농도 = OD260 × 50 × 희석배수 (μg/mL). 순도: 260/280 ≥ 1.8 + 260/230 ≥ 2.0이면 PCR·시퀀싱 가능. 겔에서 wells 근처 단일 고분자 band → genomic 무결성. smear 보이면 분해됨.
예비보고서 항목별 작성 팁
이론
각 시약의 역할(EDTA chelation, SDS 변성, EtOH 침전 메커니즘) 명확히.
결과
OD 표 + 겔 사진 + 추출 수율(μg DNA / g 시료).
고찰
260/280·230 비율로 오염 판단, 수율이 낮을 때 가능한 원인 분석.
자주 하는 실수
- — DNase 오염 — 모든 도구 멸균, EDTA 필수, 얼음 위 작업
- — Phenol 흡입 — 흄후드 안에서, glove 필수
- — 이소프로판올 침전 시 너무 강하게 vortex — DNA 절단됨
- — DNA pellet 너무 건조 → TE에 잘 녹지 않음 (10 min 풍건이면 충분)
자주 묻는 질문
Q. CTAB과 SDS는 언제 어떤 걸 쓰나요?
CTAB은 식물 시료의 다당류·페놀 화합물 제거에 강력하므로 식물 표준. SDS는 동물세포·박테리아의 단백질 변성에 효율적이고 더 빠름. 식물에 SDS만 쓰면 다당류·페놀이 침전되어 DNA를 갈색으로 오염시킴.
Q. 260/280이 1.6이면 어떻게 하나요?
단백질 오염. Proteinase K 처리 시간을 늘리거나 phenol-chloroform 1회 더 수행. 키트 사용 시 column wash를 추가. 이미 정제된 시료라면 새 column이나 ethanol precipitation으로 재정제.